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: 如何溶解多肽?

: 我們建議在溶解之前用蒸餾水或無菌水進行小試,對于較短的寡肽(小于5aa)常常能夠直接溶解。對于其他的多肽,大多需要根據多肽的序列優化溶解條件,并測試幾種不同的溶劑,直至找到最優方法(超聲處理有助于打碎顆粒,增加溶解度)。
   多肽的極性對溶解度有很大的影響:酸性的蛋白易溶解于堿性溶液,而酸性溶液則適合堿性蛋白。可以用下表

氨基酸的酸堿度值的加和來計算多肽的酸堿度


按上述原則,得分大于0為堿性多肽,得分小于0的為酸性多肽,得分為0為中性多肽。

舉例說明:

RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 認為是堿性多肽
EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 認為是酸性多肽
AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 認為是中性多肽

1. 對于堿性多肽,如果純水無法溶解,請嘗試10% - 30%的醋酸;如果多肽還是不溶,測試純醋酸和三氟乙酸TFA(<50 μl)來溶解,然后將多肽溶液稀釋到需要的濃度。
    2. 對于酸性多肽,如果純水無法溶解,請嘗試13% 氨水(v/v)來溶解,并稀釋至所需濃度。如果多肽序列中包含半胱氨酸CysC),不能用氨水溶解,需使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮 (NMP)進行溶解。對于容易聚集的多肽,則選擇6M的胍鹽酸(guanidine?HCl)或8M的尿素(Urea)來溶解,然后稀釋到需要的濃度。
    3. 中性多肽應選用機溶劑來溶解。首先,嘗試使用乙腈 (acetonitrile) ,或甲醇 (methanol) 或異丙醇 (isopropanol)進行溶解;對于疏水性非常強的多肽,先用少量的二甲基亞砜(DMSO)溶解,并用水稀釋到需要的濃度。同理,如果多肽序列中包含半胱氨酸CysC),需使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮 (NMP)進行溶解。對于容易聚集的多肽,則選擇6M的胍鹽酸(guanidine?HCl)或8M的尿素(Urea)來溶解,然后稀釋到需要的濃度。

 

: 如何保存多肽?

: 1. 為了方便儲存及后續使用,建議將多肽溶解至濃度為1-2 mg/ml左右。

2. 為了防止或盡量減少多肽降解,請將多肽以凍干粉形式保存在-20°C-80°C更佳。如果需要保存溶液肽,最好分成小樣存放,以避免反復凍融。一份樣品融凍后未用完,應扔掉。細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩,所以請將肽溶于無菌水或肽溶液過濾除菌。

3. 多肽序列中含有甲硫氨酸MetM),半胱氨酸CysC)或酪氨酸TyrY),建議保存于無氧環境防止氧化。

 

: 如何選擇適合自己研究的多肽純度?

: 粗品肽不推薦用于生物實驗。粗肽可能含有大量的非肽類雜質,如殘留的有機溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除,通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘留的TFA影響您的實驗,我們推薦其他鹽形式,如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這些鹽通常比常規TFA鹽貴20-30%以上。這是由于在轉化過程中出現更多的肽損失和需要更多的原材料。

NovoPro建議對各種項目采用以下級別的肽純度:

研究自己的多肽純度需要解決的問題 

: 收到多肽后該如何處理和保存多肽?

: 凍干粉形式的多肽,經密封包裝可在常溫條件下穩定運輸,溶解狀態的多肽不宜長期保存。

多肽保存指南:需要長期保存的多肽,應以凍干粉形式存放在含有干燥劑的密封容器內,置于-20℃保存,-80℃效果更好,可以最大限度地避免多肽降解。這種儲存方式可以使多肽可保存數年,避免了被細菌降解和氧化,也可以避免二級結構的形成。

打開包裝: 在打開包裝和稱重前,請先將多肽在干燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性,未經平衡到室溫的多肽在打開蓋子后易凝結,從而降低了多肽產品的穩定性。

稱重: 迅速稱取您所需的多肽,并將剩余多肽繼續儲存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比,含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

 

: 什么是多肽的純度?

: 多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測到的目標多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長),紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽分。但可發現其他的雜質包括:缺失序列(缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列),截斷序列(加帽過程中產生的序列)脫保護不完全序列(產生于整個合成過程或最后的裂解過程)。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會產生少量的TFA,如:游離的氨基末端和其他側鏈如ArgLysHis都可生成少量TFA雜質。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態,水也會因共價結合的能力不同而不同程度地存在著。

在多肽中還存在哪些物質(雜質)?

多肽純度中包含的雜質

純化前的多肽中包含的雜質包括多肽和非多肽物質, 純化后的多肽中包含的雜質除了TFA鹽,大多數為序列被修改的多肽。

1缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列

2為避免缺失序列的產生而進行的加帽操作,截斷序列即產生于加帽過程中

3產生于整個合成過程或最后的裂解過程

4保護基重新附著在多肽的其他位置

 

: 固拓生物如何對合成的多肽進行質檢?

: 所有合成肽都經過HPLCMS分析,并提供相應的檢測報告。所有多肽均采用反相色譜法純化,以質譜法測定肽的分子量來確定產品是否正確,MS檢測結果還可顯示大部份的主要雜質。如果必要,還可提供肽凈含量檢測,如氨基酸分析或元素分析。這些方法可以證實多肽的氨基酸組成,他們均可作為多肽確認的補充方法。所有交付的肽均達到了客戶要求的純度。沒有達到純度要求的那些多肽均被丟棄。當然如果客戶需要,也可以發送給他們。

 

: 如何解釋MALDI(MS)中的P+Na P+K?

: 經常會在MALDI中看到Na峰和K峰,鈉和鉀來源于溶劑水。即便是蒸餾水和去離子水也會 含有痕量的鈉離子和鉀離子,無法完全除去。它們在進行質譜分析時也會離子化并與肽的自由羧基結合。因為沒有純化水的系統將水中的鈉離子和鉀離子除去,所以有時候在MALDI MS圖譜中出現鈉峰和鉀峰也是再所難免的。

 

: 為什么要進行N端乙酰化,C端酰胺化修飾?

: 這些修飾可以使肽不會被降解掉,也可以使肽模擬它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀態。

 

: 如何將多肽溶解在DMSO?

: 二甲基亞砜(DMSO)是一種含硫有機化合物,分子式為(CH3)2SO,常溫下為無色無臭的透明液體。DMSO作為冷凍保護劑經常應用于細胞庫。在細胞冷凍過程中,DMSO可防止胞內/胞外晶體的形成,其工作濃度為10%DMSO通常可與鹽或血清白蛋白結合。

疏水性多肽可以很容易地溶解在DMSO中。但DMSO可增加細胞的通透性,若多肽溶解于DMSO中則會對細胞產生毒性作用。高濃度的DMSO絕不可應用于細胞培養中。濃度為5%DMSO即可讓細胞膜溶解。大多數細胞株可以容忍0.5% DMSO,少許可以容忍1%的濃度,而不表現出嚴重的細胞毒性。然而原代細胞培養對其更敏感。所以如果是用原代細胞做劑量/反應曲線(可行性),其濃度應低于0.1%

對于某些疏水性非常高的多肽,可先嘗試將其溶解在少量的DMSO(30-50ul,100%)中,然后慢慢 (一滴一滴地)將其添加到不斷攪拌的水溶液如PBS或其他想要的緩沖液中,直至理想濃度。如果滴加過程中,肽溶液開始變渾濁,說明已經達到了溶解極限。另外,超聲波有助于多肽溶解。

經驗:

對幾乎所有的細胞來說,濃度為0.1%DMSO是安全的。

廣泛被用于細胞培養的DMSO終濃度為0.5%,不會引起細胞毒性。

雖然對部份細胞來說,1%DMSO也不會產生細胞毒性,但我們推薦0.5%

也有5%DMSO成功地應用于某些細胞的案例。

始終保持終濃度在0.5%,但儲存時可200倍高濃度溶于100%DMSO中。

 

: 磷酸化修飾多肽的設計有什么建議?

: 隨著長度的增加,從磷酸化的那個氨基酸往后偶聯效率逐漸降低。合成方向從C端到N端,建議磷酸化的那個氨基酸以后的殘基不要超過10 個,也就是說從N端往C端數磷酸化氨基酸之前的氨基酸殘基最好不要超過10個。

 

: 如何選擇多肽N端修飾和C端修飾?

: 肽的末端默認為N端游離的氨基,C端游離的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列,為了與母本蛋白更為接近,肽末端往往需要封閉,即N端乙酰化,C端酰胺化,這種修飾避免引入多余電荷,也使其更能防止外切酶作用,使肽更加穩定。

 

: 我需要合一條環肽,其中含有一個色氨酸,它會被氧化嗎?

: 色氨酸的氧化是肽氧化中的常見現象,而肽一般是先環化再純化,如果其中的色氨酸發生了氧化作用,肽在HPLC柱上的滯留時間會發生變化,因此被氧化的肽可以通過純化去除。另外,氧化的肽也可以通過MS檢測到。

 

: 如何確定肽已成環?

: 一般采用Ellman反應來檢測成環反應是否完全。 如果Ellman檢測結果為陽性(黃色),說明成環反應不完全;如果檢測結果為陰性(不是黃色),說明成環反應已進行完全。

 

: 含有Cys的多肽在出貨前經過還原了嗎?

: 如果沒有發現肽已經被氧化,我們一般不對Cys進行還原。所有的多肽都是由粗品在pH 2條件 下純化、凍干后得到的,這樣的pH條件至少在某種程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般 在pH 2條件下進行純化,除非有特殊原因需要在pH6.8條件下純化。如果純化在pH6.8進行, 純化產物必須馬上用酸處理以防氧化。在最后的質量控制環節,對于含有Cys的肽,如果MS圖譜上發現有分子量為(2P+H)的物質存在,說明Cys已經氧化形成二聚體。如果MSHPLC都沒有問題,我們就直接凍干后出貨。需 要指明的是,含有Cys的肽隨著時間的推移會發生緩慢的氧化,氧化程度主要取決于肽序列及貯存條件。

 

: 熒光標記時,肽和修飾標記的染料之間需要加一個間隔嗎?

: 多數染料屬于大分子量芳香族氨基酸,為了避免多肽與熒光標簽之間發生相互作用(比如,FITC很容易結合多肽序列中的半胱氨酸殘基或者賴氨酸殘基。),維持蛋白的構象及其生物學活性,我們推薦引入一個可彎曲的間隔區,比如Ahx, Ahx是一個含有6碳分子的環狀結構,可以維持熒光標簽的穩定性。

通常情況下,生物素、FITC一類的染料既可以標記在蛋白的氨基端也可以標記在蛋白的羧基端。然而,為了在最短時間內,最便捷又高效地合成多肽,固拓生物推薦客戶選擇標記在氨基端。因為一個多肽的合成往往是從羧基端開始的,這樣一來,氨基端的修飾便成為最后一個環節,不需要再進行特別的結合作用。反之,羧基端修飾需要額外的環節,因此過程更加復雜。

 

: 多肽一般有哪幾種鹽的形式?通過什么方式轉鹽或脫鹽?

: 多數多肽都是在TFA體系下分離純化的,所以多肽以TFA鹽的形式最多,其次藥物肽一般有醋酸鹽及鹽酸鹽的形式,極少數藥物肽會有一些特殊的鹽形式。轉鹽方式多為離子交換法和HPLC法,而脫鹽可用G25(安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠)柱。一般醋酸鹽及鹽酸鹽的價格比TFA的價格高出20%-30%

 

: 在多肽檢測過程中經常出現基線漂移的原因是什么?怎么解決?

: 固定三氟乙酸(TFA)濃度的梯度洗脫有時會在210-220nm檢測處造成吸收基線的漂移,這是許多反相分離中基線漂移的原因。 降低或消除由于三氟乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測波長靠近215nm,并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三氟乙酸補償基線漂移。列如,溶劑A中的三氟乙酸為0.1%時,溶劑B中可用0.085%

 

: 影響多肽純度檢測結果的因素有哪些

: 影響多肽純度檢測結果的因素很多,主要包括:流動相體系、色譜柱型號、柱溫、波長及色譜儀的性能指標,每一項不同都可能造成結果產生誤差。

 

: 有哪些流動相體系或離子對試劑可用于多肽的分離純化?

: 目前,最常用的離子對試劑是三氟乙酸(TFA),三氟乙酸能調節洗脫液的PH,同時作為離子對試劑與多肽相互作用,從而增強分離效果,明顯改善峰形。 其它可用于多肽分離純化的流動相體系或離子對試劑包括醋酸體系,磷酸體系,鹽酸體系,七氟丁酸等,通過適當的調節PH都能取得很好的分離效果。

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